伊莎贝拉公主（Infanta Isabella）于1503年出生在里斯本的阿尔卡索瓦宫（Paço da Alcáçova），是葡萄牙国王曼努埃尔一世与其第二任妻子——阿拉贡与卡斯蒂利亚的玛丽亚王后——之女。她的哥哥若昂（John）出生于前一年6月，后来继承父位，成为葡萄牙国王若昂三世。继伊莎贝拉之后，家中又添了贝阿特丽丝（1504年）、路易斯（1506年）、费尔南多（1507年）、阿方索（1509年）、玛丽亚（1511年）、恩里克（1512年）、杜阿尔特（1515年）和安东尼奥（1516年）等子女。玛丽亚王后在1517年去世时年仅34岁，她为曼努埃尔一世生育了十个子女，从而确保了葡萄牙王室血脉的延续。当时的葡萄牙正处于国内和平与繁荣的时期，这得益于其建立的跨洋帝国；到了16世纪，该帝国版图已横跨三大洲，涵盖了大西洋诸岛、圣克鲁斯省（Province of Santa Cruz）、东方领地、非洲贸易据点以及摩洛哥境内的葡萄牙堡垒。
尽管男性继承人通常享有优先权，但在复杂的王朝联姻博弈中，王室女儿也是极具价值的筹码。到1515年底，葡萄牙王室意欲将长女伊莎贝拉许配给哈布斯堡家族的查理（Charles of Habsburg，生于1500年）一事已显而易见；查理是“天主教双王”（Catholic Monarchs）与皇帝马克西米利安的长孙，而当时的奥地利王朝正准备通过他继承卡斯蒂利亚与阿拉贡的王位。曼努埃尔一世在1517年的遗嘱中明确记录了这一愿望，并敦促其继任者促成这桩婚事。后来，伊莎贝拉本人似乎也信奉“Aut Caesar aut nihil”（意为“不为凯撒，便一无所有”）这一格言；据信，这正是她婚前的个人座右铭。 1518年，在玛丽亚王后去世后，随着哈布斯堡家族的查理（Charles of Habsburg）继任卡斯蒂利亚和阿拉贡国王，伊比利亚半岛政局发生变动，曼努埃尔一世（Manuel I）再次成婚，迎娶了查理的姐姐埃莉诺（Eleanor，生于1498年）。当1520年卡斯蒂利亚爆发“公社暴动”（Revolt of the Comuneros）时，这一新的王朝联姻关系影响了曼努埃尔一世在半岛的政治决策。他对查理提供的政治、财政及后勤支持，在镇压这场挑战哈布斯堡统治者合法性的起义中发挥了决定性作用。曼努埃尔一世或许曾认为，这种支持对于促成伊莎贝拉（Isabella）的婚事同样具有决定性意义；然而，这一联姻最终是在若昂三世（John III）统治时期得以落实的。
1525年，在托雷斯诺瓦斯（Torres Novas）召开的议会（Cortes）上，卡斯蒂利亚使节与国王代表签署了婚约。若昂三世为妹妹提供了极其丰厚的嫁妆，从而促成了这一协议的达成，也实现了被誉为“幸运者”（the Fortunate）的曼努埃尔一世长久以来的夙愿。该协议随后在托莱多（Toledo）获得了卡斯蒂利亚议会的批准。随后，葡萄牙宫廷启程前往阿尔梅林（Almeirim）；1525年11月1日，葡萄牙的伊莎贝拉与查理五世（Charles V）在那里的宏伟王宫内举行了代理婚礼。1526年1月30日，伊莎贝拉在国王及庞大随从队伍的陪同下启程前往边境。王室一行于2月5日抵达埃尔瓦斯（Elvas）；此时，卡斯蒂利亚代表团已在巴达霍斯（Badajoz）等候，随后举行了正式的公主移交仪式。1526年3月11日，葡萄牙的伊莎贝拉与皇帝查理五世在塞维利亚王宫（Royal Alcázar of Seville）举行了宗教婚礼；尽管这场婚姻最初出于政治权宜之计，但两人最终发展出了真挚的爱情。继若昂三世迎娶这位“国王兼皇帝”的妹妹——奥地利的凯瑟琳（Catherine of Austria）之后，伊莎贝拉与查理五世的结合进一步巩固了阿维斯王朝统治下的葡萄牙与哈布斯堡王朝统治下的西班牙之间的王朝纽带。
