La infanta Isabel, hija del rey Manuel I de Portugal y de su segunda esposa, la reina María de Aragón y Castilla, nació en Lisboa, en el Paço da Alcáçova, en 1503. Su hermano mayor, Juan, había nacido en junio del año anterior y más tarde sucedería a su padre en el trono como el rey Juan III de Portugal. Tras Isabel nacieron Beatriz (1504), Luis (1506), Fernando (1507), Alfonso (1509), María (1511), Enrique (1512), Duarte (1515) y Antonio (1516). Antes de su muerte en 1517, a los 34 años, la reina María había dado a luz a diez hijos de Manuel I, asegurando así la continuidad de la casa real portuguesa. Portugal disfrutaba entonces de un periodo de paz interna y prosperidad, sustentado por el establecimiento de un imperio transoceánico que, ya en el siglo XVI, se extendía por tres continentes y abarcaba las islas del Atlántico, la provincia de Santa Cruz, los dominios en Oriente, las factorías africanas y las plazas fuertes portuguesas en Marruecos.
Aunque los herederos varones gozaban naturalmente de prioridad, las hijas de los reyes constituían activos inestimables en el complejo juego de las alianzas dinásticas. A finales de 1515 había quedado claro que los soberanos portugueses pretendían casar a su hija mayor, Isabel, con Carlos de Habsburgo (n. 1500) —nieto mayor de los Reyes Católicos y del emperador Maximiliano—, en un momento en que la dinastía austriaca estaba a punto de heredar las coronas de Castilla y Aragón a través de Carlos. Manuel I dejó constancia expresa de este deseo en su testamento de 1517, instando a su sucesor a llevar a cabo dicho matrimonio. Con el tiempo, parece que la propia Isabel hizo suya la máxima *Aut Caesar aut nihil* («O César o nada»), que se cree sirvió como su lema personal antes de contraer matrimonio. En 1518, tras la muerte de la reina María y en el contexto de los cambios políticos en la península ibérica derivados del ascenso de Carlos de Habsburgo a los tronos de Castilla y Aragón, Manuel I contrajo nuevas nupcias, esta vez con Leonor (n. 1498), hermana mayor de Carlos. Este nuevo vínculo dinástico influyó en la política peninsular de Manuel I cuando, en 1520, estalló en Castilla la Rebelión de los Comuneros. Su apoyo político, financiero y logístico a Carlos resultó decisivo para sofocar el levantamiento, que cuestionaba la legitimidad del monarca Habsburgo. Es muy probable que Manuel I creyera que dicho apoyo también sería determinante para lograr el matrimonio de Isabel. Sin embargo, fue durante el reinado de Juan III cuando finalmente se concretó esta alianza matrimonial.
En 1525, durante las Cortes convocadas en Torres Novas, los embajadores castellanos y los representantes del rey firmaron el contrato matrimonial, hecho posible gracias a la dote excepcionalmente generosa que Juan III otorgó a su hermana, cumpliendo así la anhelada ambición de «el Afortunado», como se conocía a Manuel I. El acuerdo fue ratificado posteriormente por las Cortes castellanas en Toledo. La corte portuguesa se trasladó entonces a Almeirim, donde, en el magnífico palacio real, tuvo lugar el 1 de noviembre de 1525 el matrimonio por poderes entre Isabel de Portugal y Carlos V. El 30 de enero de 1526, Isabel partió hacia la frontera acompañada por el rey y un numeroso séquito. La comitiva real llegó a Elvas el 5 de febrero; la delegación castellana aguardaba ya en Badajoz, momento en el que se produjo la entrega formal de la infanta. El 11 de marzo de 1526, Isabel de Portugal y el emperador Carlos V contrajeron matrimonio en una ceremonia religiosa celebrada en el Real Alcázar de Sevilla; aunque concertado por conveniencia política, el enlace se convirtió en una unión basada en el amor verdadero. Poco después del matrimonio de Juan III con Catalina de Austria —hermana menor del rey-emperador—, la unión de Isabel y Carlos V reforzó aún más los vínculos dinásticos entre la Portugal de la casa de Avis y la España de los Habsburgo.
