Fille du roi Manuel Ier de Portugal et de sa seconde épouse, la reine Marie d'Aragon et de Castille, l'infante Isabelle naquit à Lisbonne, au palais de l'Alcáçova, en 1503. Son frère aîné, Jean, né en juin de l'année précédente, succéderait plus tard à leur père sur le trône sous le nom de Jean III de Portugal. Après Isabelle vinrent au monde Béatrice (1504), Louis (1506), Ferdinand (1507), Alphonse (1509), Marie (1511), Henri (1512), Édouard (1515) et Antoine (1516). Avant sa mort en 1517, à l'âge de 34 ans, la reine Marie avait donné dix enfants à Manuel Ier, assurant ainsi la pérennité de la maison royale portugaise. Le Portugal connaissait alors une période de paix intérieure et de prospérité, soutenue par l'établissement d'un empire transocéanique qui, au XVIe siècle, s'étendait sur trois continents, englobant les îles de l'Atlantique, la province de Santa Cruz, les possessions en Orient, les comptoirs africains et les places fortes portugaises au Maroc.
Bien que les héritiers mâles eussent naturellement la priorité, les filles de la famille royale constituaient des atouts précieux dans le jeu complexe des alliances dynastiques. Dès la fin de 1515, il apparut clairement que les souverains portugais avaient l'intention de marier leur fille aînée, Isabelle, à Charles de Habsbourg (né en 1500) — petit-fils aîné des Rois catholiques et de l'empereur Maximilien —, à une époque où la dynastie autrichienne s'apprêtait à hériter des couronnes de Castille et d'Aragon par l'intermédiaire de Charles. Manuel Ier consigna expressément ce souhait dans son testament de 1517, exhortant son successeur à concrétiser cette union. Avec le temps, Isabelle elle-même semble avoir fait sienne la maxime *Aut Caesar aut nihil* (« Ou César ou rien »), qui aurait servi de devise personnelle avant son mariage. En 1518, après la mort de la reine Marie et dans le contexte des bouleversements politiques de la péninsule Ibérique liés à l'avènement de Charles de Habsbourg sur les trônes de Castille et d'Aragon, Manuel Ier se remaria avec Éléonore (née en 1498), la sœur aînée de Charles. Ce nouveau lien dynastique influença la politique péninsulaire de Manuel Ier lorsque, en 1520, la révolte des Comuneros éclata en Castille. Son soutien politique, financier et logistique à Charles s'avéra décisif pour réprimer ce soulèvement qui remettait en cause la légitimité du souverain Habsbourg. Manuel Ier espérait sans doute que ce soutien jouerait également un rôle déterminant dans la concrétisation du mariage d'Isabelle. C'est toutefois sous le règne de Jean III que cette alliance matrimoniale fut finalement scellée.
En 1525, lors des Cortes réunies à Torres Novas, les ambassadeurs castillans et les représentants du roi signèrent le contrat de mariage, rendu possible par la dot exceptionnellement généreuse que Jean III accorda à sa sœur, réalisant ainsi l'ambition longtemps caressée par celui que l'on surnommait « le Fortuné ». L'accord fut par la suite ratifié par les Cortes castillanes à Tolède. La cour portugaise se rendit ensuite à Almeirim où, dans le magnifique palais royal, fut célébré le 1er novembre 1525 le mariage par procuration entre Isabelle de Portugal et Charles Quint. Le 30 janvier 1526, Isabelle prit la route de la frontière, accompagnée du roi et d'une nombreuse suite. Le cortège royal atteignit Elvas le 5 février ; la délégation castillane attendait déjà à Badajoz, lieu où eut lieu la remise officielle de l'infante. Le 11 mars 1526, Isabelle de Portugal et l'empereur Charles Quint furent unis lors d'une cérémonie religieuse à l'Alcazar royal de Séville ; bien que motivée par des impératifs politiques, cette union se transforma en un véritable mariage d'amour. Peu après le mariage de Jean III avec Catherine d'Autriche, sœur cadette du roi-empereur, l'union d'Isabelle et de Charles Quint vint renforcer davantage les liens dynastiques entre le Portugal de la dynastie d'Aviz et l'Espagne des Habsbourg.
