Die Infantin Isabella, Tochter von König Manuel I. von Portugal und seiner zweiten Gemahlin, Königin Maria von Aragón und Kastilien, wurde 1503 in Lissabon im Paço da Alcáçova geboren. Ihr älterer Bruder Johann war im Juni des Vorjahres zur Welt gekommen und sollte später als König Johann III. von Portugal die Nachfolge ihres Vaters auf dem Thron antreten. Nach Isabella folgten Beatrice (1504), Ludwig (1506), Ferdinand (1507), Alfons (1509), Maria (1511), Heinrich (1512), Duarte (1515) und António (1516). Vor ihrem Tod im Jahr 1517 im Alter von 34 Jahren hatte Königin Maria Manuel I. zehn Kinder geboren und damit den Fortbestand des portugiesischen Königshauses gesichert. Portugal erlebte zu jener Zeit eine Phase inneren Friedens und Wohlstands, gestützt durch den Aufbau eines transozeanischen Reiches, das sich im 16. Jahrhundert über drei Kontinente erstreckte und die Atlantikinseln, die Provinz Santa Cruz, die Besitzungen im Osten, die afrikanischen Handelsniederlassungen sowie die portugiesischen Stützpunkte in Marokko umfasste.
Obwohl männliche Erben naturgemäß den Vorzug genossen, waren Königstöchter von unschätzbarem Wert im komplexen Spiel dynastischer Bündnisse. Ende 1515 zeichnete sich ab, dass die portugiesischen Herrscher beabsichtigten, ihre älteste Tochter Isabella mit Karl von Habsburg (geb. 1500) zu vermählen – dem ältesten Enkel der Katholischen Könige und Kaiser Maximilians –, und zwar zu einem Zeitpunkt, als die österreichische Dynastie durch Karl vor der Übernahme der Kronen von Kastilien und Aragón stand. Manuel I. hielt diesen Wunsch ausdrücklich in seinem Testament von 1517 fest und mahnte seinen Nachfolger, die Eheschließung zu verwirklichen. Im Laufe der Zeit scheint sich Isabella selbst den Wahlspruch *Aut Caesar aut nihil* – „Entweder Cäsar oder nichts“ – zu eigen gemacht zu haben; dieser gilt als ihr persönliches Motto in der Zeit vor ihrer Heirat. Im Jahr 1518, nach dem Tod von Königin Maria und vor dem Hintergrund der politischen Veränderungen auf der Iberischen Halbinsel durch die Thronbesteigung Karls von Habsburg in Kastilien und Aragon, heiratete Manuel I. erneut – diesmal Eleonore (geb. 1498), die ältere Schwester Karls. Diese neue dynastische Verbindung beeinflusste Manuel I. in seiner Politik auf der Halbinsel, als 1520 in Kastilien der Comuneros-Aufstand ausbrach. Seine politische, finanzielle und logistische Unterstützung für Karl erwies sich als entscheidend für die Niederschlagung des Aufstands, der die Legitimität des habsburgischen Herrschers infrage gestellt hatte. Manuel I. mag geglaubt haben, dass eine solche Unterstützung auch für das Zustandekommen der Heirat Isabellas ausschlaggebend sein würde. Doch erst während der Regierungszeit Johanns III. wurde das Heiratsbündnis schließlich besiegelt.
Im Jahr 1525 unterzeichneten die kastilischen Gesandten und die Vertreter des Königs auf den in Torres Novas einberufenen Cortes den Heiratsvertrag; ermöglicht wurde dies durch die außerordentlich großzügige Mitgift, die Johann III. seiner Schwester gewährte, womit er den lang gehegten Wunsch jenes Herrschers erfüllte, der als „der Glückliche“ (o Venturoso) bekannt war. Die Vereinbarung wurde anschließend von den kastilischen Cortes in Toledo ratifiziert. Der portugiesische Hof begab sich daraufhin nach Almeirim, wo am 1. November 1525 im prächtigen Königspalast die Trauung von Isabella von Portugal und Karl V. per Stellvertreter stattfand. Am 30. Januar 1526 brach Isabella in Begleitung des Königs und eines großen Gefolges zur Grenze auf. Die königliche Reisegesellschaft erreichte am 5. Februar Elvas; die kastilische Delegation wartete bereits in Badajoz, woraufhin die formelle Übergabe der Infantin erfolgte. Am 11. März 1526 wurden Isabella von Portugal und Kaiser Karl V. im Königlichen Alcázar von Sevilla kirchlich getraut; obgleich aus politischem Kalkül arrangiert, entwickelte sich die Ehe zu einer echten Liebesverbindung. Kurz nach der Vermählung Johanns III. mit Katharina von Österreich, der jüngeren Schwester des Königs und Kaisers, festigte die Verbindung zwischen Isabella und Karl V. die dynastischen Bande zwischen dem Haus Avis (Portugal) und dem Haus Habsburg (Spanien) weiter.
