Figlia del re Manuele I del Portogallo e della sua seconda moglie, la regina Maria d'Aragona e Castiglia, l'infanta Isabella nacque a Lisbona, presso il Paço da Alcáçova, nel 1503. Suo fratello maggiore, Giovanni, era nato nel giugno dell'anno precedente e avrebbe poi succeduto al padre sul trono come re Giovanni III del Portogallo. Dopo Isabella vennero al mondo Beatrice (1504), Luigi (1506), Ferdinando (1507), Alfonso (1509), Maria (1511), Enrico (1512), Duarte (1515) e Antonio (1516). Prima della sua morte, avvenuta nel 1517 all'età di 34 anni, la regina Maria aveva dato a Manuele I dieci figli, garantendo così la continuità della casa reale portoghese. Il Portogallo godeva allora di un periodo di pace interna e prosperità, sostenuto dalla creazione di un impero transoceanico che, nel corso del XVI secolo, si estendeva su tre continenti, comprendendo le isole atlantiche, la Provincia di Santa Cruz, i domini in Oriente, gli scali commerciali africani e le roccaforti portoghesi in Marocco.
Sebbene gli eredi maschi avessero naturalmente la precedenza, le figlie dei sovrani rappresentavano una risorsa preziosa nel complesso gioco delle alleanze dinastiche. Verso la fine del 1515 divenne chiaro che i sovrani portoghesi intendevano dare in sposa la loro figlia maggiore, Isabella, a Carlo d'Asburgo (nato nel 1500) — il nipote primogenito dei Re Cattolici e dell'imperatore Massimiliano — proprio mentre la dinastia austriaca si apprestava a ereditare, attraverso Carlo, le corone di Castiglia e Aragona. Manuele I espresse esplicitamente questo desiderio nel suo testamento del 1517, esortando il successore a portare a compimento il matrimonio. Col tempo, la stessa Isabella sembrò fare propria la massima *Aut Caesar aut nihil* ("O Cesare o nulla"), che si ritiene le sia servita da motto personale prima delle nozze. Nel 1518, in seguito alla morte della regina Maria e nel contesto dei mutamenti politici nella penisola iberica legati all'ascesa di Carlo d'Asburgo ai troni di Castiglia e Aragona, Manuele I contrasse un nuovo matrimonio, questa volta con Eleonora (nata nel 1498), sorella maggiore di Carlo. Questo nuovo legame dinastico influenzò la politica peninsulare di Manuele I quando, nel 1520, scoppiò in Castiglia la rivolta dei Comuneros. Il suo sostegno politico, finanziario e logistico a Carlo si rivelò decisivo per reprimere l'insurrezione, che metteva in discussione la legittimità del sovrano asburgico. È assai probabile che Manuele I ritenesse che tale appoggio si sarebbe rivelato determinante anche per la realizzazione del matrimonio di Isabella. Tuttavia, fu durante il regno di Giovanni III che l'alleanza matrimoniale venne infine conclusa.
Nel 1525, nel corso delle Cortes convocate a Torres Novas, gli ambasciatori castigliani e i rappresentanti del re firmarono il contratto di matrimonio, reso possibile dalla dote eccezionalmente generosa che Giovanni III concesse alla sorella, realizzando così l'ambizione a lungo coltivata da "l'Avventuroso" (epiteto con cui era noto Manuele I). L'accordo fu successivamente ratificato dalle Cortes castigliane a Toledo. La corte portoghese partì quindi alla volta di Almeirim dove, nel magnifico palazzo reale, il 1° novembre 1525 ebbe luogo il matrimonio per procura tra Isabella del Portogallo e Carlo V. Il 30 gennaio 1526, Isabella si mise in viaggio verso il confine, accompagnata dal re e da un numeroso seguito. Il corteo reale giunse a Elvas il 5 febbraio; la delegazione castigliana attendeva già a Badajoz, luogo in cui avvenne la consegna formale dell'Infanta. L'11 marzo 1526, Isabella del Portogallo e l'imperatore Carlo V si unirono in matrimonio con una cerimonia religiosa presso l'Alcázar reale di Siviglia; sebbene organizzate per ragioni di opportunità politica, le nozze si trasformarono in un matrimonio fondato su un autentico sentimento amoroso. Poco dopo il matrimonio di Giovanni III con Caterina d'Austria, sorella minore del re-imperatore, l'unione tra Isabella e Carlo V rafforzò ulteriormente i legami dinastici tra il Portogallo degli Aviz e la Spagna degli Asburgo.
