Инфанта Изабелла, дочь короля Португалии Мануэла I и его второй супруги, королевы Марии Арагонской и Кастильской, родилась в Лиссабоне, во дворце Пасу-да-Алкасова, в 1503 году. Её старший брат Жуан, родившийся в июне предыдущего года, впоследствии унаследовал отцовский трон и стал королем Португалии Жуаном III. Вслед за Изабеллой на свет появились Беатриса (1504), Луиш (1506), Фернанду (1507), Афонсу (1509), Мария (1511), Энрике (1512), Дуарте (1515) и Антониу (1516). К моменту своей смерти в 1517 году в возрасте 34 лет королева Мария родила Мануэлу I десятерых детей, тем самым обеспечив продолжение португальского королевского рода. В ту пору Португалия переживала период внутреннего мира и процветания, фундаментом которого служила созданная ею трансокеанская империя; к XVI веку владения этой империи простирались на три континента, охватывая острова Атлантики, провинцию Санта-Крус, земли на Востоке, торговые фактории в Африке и португальские опорные пункты в Марокко.
Хотя наследники мужского пола, разумеется, имели преимущество, дочери монархов играли неоценимую роль в сложной системе династических союзов. К концу 1515 года стало очевидно, что португальские монархи намерены выдать свою старшую дочь Изабеллу замуж за Карла Габсбурга (род. 1500) — старшего внука Католических королей и императора Максимилиана; в то время австрийская династия готовилась унаследовать короны Кастилии и Арагона именно через Карла. Мануэл I особо зафиксировал это намерение в своем завещании 1517 года, настоятельно призывая преемника осуществить этот брак. Со временем и сама Изабелла, по-видимому, приняла принцип *Aut Caesar aut nihil* («Или Цезарь, или ничто»); считается, что именно эта фраза служила её личным девизом до вступления в брак. В 1518 году, после смерти королевы Марии и на фоне политических перемен на Пиренейском полуострове, связанных с восшествием Карла Габсбурга на престолы Кастилии и Арагона, Мануэл I вступил в новый брак — на этот раз с Элеонорой (род. 1498), старшей сестрой Карла. Этот новый династический союз повлиял на политику Мануэла I в регионе, когда в 1520 году в Кастилии вспыхнуло восстание комунерос. Оказанная им Карлу политическая, финансовая и материально-техническая поддержка сыграла решающую роль в подавлении мятежа, угрожавшего легитимности власти правителя из дома Габсбургов. Вполне вероятно, что Мануэл I полагал, будто эта поддержка также станет решающим фактором в заключении брака Изабеллы. Однако этот брачный союз был окончательно оформлен уже в правление Жуана III.
В 1525 году на кортесах, созванных в Торриш-Новаш, кастильские послы и представители короля подписали брачный контракт; это стало возможным благодаря исключительно щедрому приданому, которое Жуан III выделил своей сестре, тем самым исполнив давнее желание Мануэла I, прозванного «Счастливым». Впоследствии соглашение было ратифицировано кастильскими кортесами в Толедо. Затем португальский двор отправился в Алмейрин, где 1 ноября 1525 года в великолепном королевском дворце состоялось бракосочетание Изабеллы Португальской и Карла V по доверенности. 30 января 1526 года Изабелла в сопровождении короля и многочисленной свиты выехала к границе. 5 февраля королевская процессия прибыла в Элваш; в Бадахосе уже ожидала кастильская делегация, после чего состоялась официальная передача инфанты. 11 марта 1526 года в севильском Алькасаре состоялось венчание Изабеллы Португальской и императора Карла V; этот брак, изначально заключенный по политическим соображениям, со временем перерос в союз, основанный на искренней любви. Вслед за браком Жуана III с Екатериной Австрийской — младшей сестрой короля-императора — союз Изабеллы и Карла V еще больше укрепил династические связи между Португалией Ависской династии и Испанией Габсбургов.
